virus

Вирусы

Вирусы – наиболее мелкие формы живой материи. В определенном смысле вирусная частица – не живой организм. Вне клетки они инертны, некоторые даже образуют кристаллы.

История открытия вирусов фактически начинается с 1892 г. с сообщения Д.И.Ивановского в Академии наук об открытии возбудителя «табачной мозаики», в 1898 г. Леффлер и Фрош открыли возбудителя ящура, в 1915 г. Д’Эрель – вирусы бактерий – бактериофаги …

Общие признаки вирусов.

  1. Вирусы существуют в двух качественно различных формах: внеклеточной (вирион) и внутриклеточной (вирус). Вирусы – облигатные внутриклеточные паразиты – не содержат ферментов, ответственных за энергетический метаболизм, а синтез вирусных макромолекул зависит от биосинтетических процессов в клетке хозяина.
  2. Любая вирусная частица содержит нуклеоид, включающий только один тип нуклеиновых кислот (ДНК или РНК) и окруженный защитной протеиновой или смешанной (из протеинов и липидов) оболочкой. Наиболее простой вирусный геном кодирует 3-4 белка, наиболее сложный – более 50 белков, в том числе и ферментов.
  3. Вирусы поражают практически все живые организмы – бактерии, грибы, растения, животных и человека.

А. Вирусы бактерий – бактериофаги обнаружены для всех групп бактерий.

Б. Вирусы растений. Патогенными могут быть как обычные зрелые вирусы, так и вироиды (шаровидные молекулы РНК небольших размеров, лишенные оболочки).

В. Вирусы животных. Обширная группа возбудителей, поражающих как беспозвоночных, так и позвоночных, некоторые патогенны для обеих групп.

Морфология вирусов.

Форма: шаровидная, палочковидная (нитевидная), смешанная (сперматозоидная).

Нуклеиновая кислота (НК) представлена ДНК или РНК.

ДНК может быть двунитевая (чаще) или однонитевая (парвовирусы), ДНК может образовывать циркулярные ковалентно сцепленные суперспирализованные (паповавирусы) или линейные двухнитевые структуры (герпес-, аденовирусы). М.м. 106-108 Д, т.е. в 10-100 раз меньше массы бактериальной ДНК.

РНК представлена одно- или двухнитевыми молекулами, у некоторых вирионов она может быть сегментированной (например, 2 сегмента у аренавирусов, 8 – у ортомиксовирусов, 11 – у ротавирусов).

Полярность. Однонитевые РНК вирусов разделяют на 2 группы:

А) +РНК (позитивный геном) способна выполнять функцию иРНК и мРНК, т.е. способна транслировать генетическую информацию на рибосомы клетки. Одиночные цепочки +РНК имеют характерные окончания «шапочки» для специфического распознавания рибосом.

Б) –РНК (негативный геном) не способна транслировать генетическую информацию непосредственно на рибосомы (т.е.) быть как иРНК). На –РНК должна сначала синтезироваться матрица +РНК для последующей трансляции и синтеза структурной –РНК.

Капсид состоит из белковых субъединиц – капсомеров (протомеры). Капсид защищает НК вируса от внешних воздействий и обеспечивает адсорбцию и проникновение вируса в клетку через взаимодействие с клеточными рецепторами.

Число капсомеров строго специфично для каждого вида вируса. Например, вирус гепатита А – 32 капсомера, энтеровирусы – 60, аденовирусы – 252 капсомера. Капсомеры скомпанованы по 2-м типам симметрии:

  • Икосаэдральный (кубический), форма вириона сферическая (адено-, рео-, герпесвирусы)
  • Спиральный в один или два слоя, форма палочковидная (ВТМ, коронавирусы, рабдовирусы, буньямвирусы, аренавирусы).

Суперкапсид (пеплос) организован двойным слоем липидов и белков. Образуется при отпочковывании вируса от клетки при прохождении её через ЦПМ (исключение Poxviridae).

Липиды – смесь нейтральных, фосфо- и гликолипидов.

Белки – гликопротеины, например, гемагглютинины, взаимодействуют с клеточными рецепторами. Матричные М-белки формируют структурный слой на внутренней поверхности вирусной оболочки и способствуют взаимодействию с белками нуклеокапсида.

Ферменты разделяют на 2 группы: 1) участвующие в репликации и транскрипции (полимеразы, обратная транскиптаза), 2) ферменты, обеспечивающие проникновение вирусных НК в клетку и выход дочерних популяций (нейраминидаза у орто- и парамиксовирусов). Различают вирионные ферменты (обратная транскриптаза ретровирусов) и вирусиндуцированные – закодированные в вирусном геноме (РНК-полимераза орто- и парамиксовирусов, ДНК-полимераза герпесвирусов). Некоторые вирусы содержат эндонуклеазы и лигазы, обеспечивающие реализацию определенных этапов репродукции.

Классификация вирусов.

Царство Vira, 2 подцарства: РНК- и ДНК-содержащие вирусы. Таксоны: – порядок – 3

–       семейство 71 (к 23 семействам вирусов позвоночных относят вирусы человека и животных), род – 164, вид – >4000

Вирусы классифицируют по типу НК, полярности генома, сегментированность генома, наличие оболочки, одна или две цепочки НК, морфология, размеры, форма, наличие ферментов, тропность и т.д.

Различают следующие семейства РНК-содержащих вирусов позвоночных:

Семейство

Геном

Тип симметрии

Оболочка

Picornaviridae

ОН +

икосаэдрический

Caliciviridae

ОН +

Икосаэдрический

Astroviridae

ОН +

Икосаэдрический

Togaviridae

ОН +

Икосаэдрический

+

Flaviviridae

ОН +

Икосаэдрический

+

Coronaviridae

ОН +

Спиральный

+

Paramyxoviridae

ОН –

Спиральный

+

Rhabdoviridae

ОН –

Спиральный

+

Filoviridae

ОН –

Спиральный

+

Orthomyxoviridae

ОН –

Спиральный, сегментированный

+

Bunyaviridae

ОН –

Спиральный, сегментированный

+

Arenaviridae

ОН –

Спиральный, сегментированный

+

Reoviridae

ДН +

Икосаэдрический, сегментированный

Birnaviridae

ДН +

Икосаэдрический, сегментированный

Retroviridae

ОН +

с ферментом обратная транскриптаза

Спиральный или икосаэдрический

+                 

 

ДНК-содержащие вирусы

Семейство

Геном

Тип симметрии

Оболочка

Hepadnaviridae

ДН, обратная транскриптаза

Спиральный ?

+

Circoviridae

ОН

икосаэдрический

Parvoviridae

ОН

Икосаэдрический

Papovaviridae

ДН

Икосаэдрический

Adenoviridae

ДН

Икосаэдрический

Herpesviridae

ДН

Икосаэдрический

+

Poxviridae

ДН

комплексный

Iridoviridae

ДН

Икосаэдрический

+

Subviral agents: Satellites, Viroids, Prions

Deltavirus ОН РНК–, несегментированный, дефектный.

Репликация вирусов.

Взаимодействие вирус – клетка развивается по литическому пути или при стабильном взаимодействии. Чаще взаимодействие вирус – клетка приводит к гибели последней, т.е. имеет литический характер.

Стадии репликации:

1) Адсорбция на клетке реализуется через рецепторы

I фаза – ионное притяжение – неспецифический характер

II фаза – физическое прикрепление за счет комплементарности специфических рецепторов.

У клетки около 500 000 рецепторов, так что может быть множественное заражение, но обычно клетка толерантна к повторному заражению.

2) Проникновение и  “раздевание”

а) через слияние мембран вируса и клетки, обуславливаются наличием вирусных гликопротеинов (парамиксо-, ретровирусы), в результате внутренние структуры вируса оказываются в цитоплазме клетки, а вирусные оболочки на поверхности.

б) пиноцитоз (виропексис) вирус поглощается с образованием вакуоли (эндосома) вокруг вируса, с последующей депротеинизацией в фаголизосоме.

3) Синтез вирусных частиц – под влиянием ферментов и регуляторных белков (вирусных и вирусиндуцированных) происходит репликация и синтез нуклеиновых кислот и белков.

4. Полная сборка внутриклеточного вируса

Капсид связывается с нуклеиновой кислотой. У оболочечных вирусов полный нуклеокапсид связывается со специфическими локусами на ЦПМ (М-белок), обеспечивающими образование вирусной оболочки.

5. Высвобождение дочерних вирионов

“Голые”, безоболочечные, и поксвирусы освобождаются быстро, при этом клетка разрушается – лизис.

“Одетые”, оболочечные, вирусы высвобождаются медленнее, обычно почкованием.

Гибель клетки зависит от:

● раннее подавление синтеза клеточных белков;

● накопление токсических  и повреждающих вирусных компонентов

● повреждение клеточных лизосом с высвобождением их содержимого в цитоплазму.

Реже наблюдается стабильное взаимодействие, не приводящее к гибели клетки, когда нуклеиновая кислота вируса встраивается в геном клетки-хозяина (лизогения бактерий и вирусная трансформация клеток)

Некоторые ДНК-вирусы и ретровирусы вызывают латентную инфекцию. При этом ДНК вируса персистирует в цитоплазме клетки в виде плазмиды или интегрируется с хромосомой и реплицируется вместе с ней (герпес инфекция, ретровирусы могут индуцировать злокачественный рост)

Персистирующие инфекции характеризуются постепенным выделением вирусных частиц, при этом клетка не погибает (гепатит В). Часто наблюдаются у больных с иммунодефицитами.

По свойствам образующихся дочерних популяций выделяют продуктивные и абортивные инфекции (если выделяются инфекционные и авирулентные вирусы соответственно).

Методы культивирования вирусов

1) Восприимчивые лабораторные животные (мыши, крысы, хомяки и др.)

2) Куриные эмбрионы

3) Культуры клеток животных и человека

В настоящее время широко используются как в диагностических целях, так и для получения вакцин

Существует около 500 линий культур клеток растений, животных, насекомых и человека.

Различают несколько типов культур клеток:

Первичные культуры клеток

Получены путем трипсинизации органов и тканей. Используются эмбрионы кур, почки обезьян. Как правило, однослойные, выращиваются в специальных плоских сосудах – матрацах в виде монослоя. Представлен клетками смешанного типа, срок жизни ограничен до 2-3 недель, максимально 80 дней, затем погибают. У клеток одинаковое число хромосом. Клетки наиболее чувствительны для репликации вирусов. Чаще используются как субстрат для получения вакцин, поскольку ДНК таких клеток не трансформирована и не вызывает канцерогенных эффектов.

Диплоидные клетки

Содержат диплоидный набор хромосом, они трансформированы, но безопасны для производства вакцин. Их можно диспергировать, пассировать, но не более 50 пассажей.

Перевиваемые клеточные линии

Клетки трансформированы (гетероплоидный набор хромосом).Получают из опухолевых клеток.

Неlа – рак шейки матки

Нер – рак гортани

Почки эмбриона свиньи, фибробласты мышей,

Их можно диспергировать и перевивать до бесконечности. К вирусам они менее чувствительны.

Все клеточные культуры выращиваются под слоем питательной поддерживающей среды: 199, Игла, раствор Хенкса, гидролизат лактальбумина с телячьей сывороткой и др.

Индикация вирусов

В клеточных культурах

1)гемагглютинирующей активности

2) ЦПД – способность вызывать деструктивные изменения клеток (клетки округляются, появляется зернистость, отторжение и лизис монослоя, формирование включений, формирование синцития)

3) Бляшкообразование под агаровым покрытием и окраской нейтральным красным или карбоксиметилцеллюлоза

4) Реакция гемадсорбция

5) Цветная проба

Идентификация вирусов

1. Электронная микроскопия по морфологии трудно отличить

2.ИЭМ – применяется при анализе вирусов не культивируемых in vitro

3.ИФ – для выявления Аг вирусов прямой и непрямой метод используются конъюгированные Ат (флюоресцеинизотиоцианат) яркое зеленое свечение клетки

4.Твердофазный ИФА, РИА, ИБ

5. Молекулярная гибридизация

Используется для анализа вирусных ДНК и РНК. Применяется для выявления вирусов, не культивируемых на клетках культуры ткани.Для выявления однонитчатых РНК или ДНК вируса используют специальные зонды РНК и ДНК, выявляющие комплементарные нити вирусных нуклеиновых кислот. В качестве зондов используют рекомбинантные клонированные ДНК, меченные радиоактивными  изотопами (фосфор) или биотином, который способен прочно связывать авидин – результат окраска.

6. ПЦР – амплификация генома

КОММЕНТАРИИ